ولد سيف الإسلام يوم ‏5‏2 يونيو/حزيران ‏1972‏ في معسكر باب العزيزية‏ حيث كانت تقيم أسرة الزعيم معمر ‏القذافي، وهو ابنه الثاني من زوجته الثانية الممرضة صفية فركاش. ولسيف الإسلام خمسة أشقاء من بينهم أخت واحدة‏.
درس سيف الإسلام في مدارس طرابلس وتخصص في الهندسة المعمارية ليتخرج عام 1994 من كلية الهندسة بطرابلس، ثم التحق عام 1998 بكلية الاقتصاد في جامعة "إمادك" بالنمسا وتخرج منها عام 2000، وبعدها التحق بمعهد للاقتصاد في بريطانيا لينال منه شهادة الدكتوراه، حيث ذكرت صحف بريطانية أنه سرق أطروحته التي حصل بها على الدكتوراه، وأن أكاديميا ليبيا ساعده في إعدادها وقد كافأه بتعيينه سفيرا.

التحق سيف الإسلام بعد تخرجه بمركز البحوث الصناعية في طرابلس‏، وعمل عام 1996 في مكتب استشاري.
مُنح رتبة رائد في الجيش الليبي بالرغم من أنه لم ينتسب إلى أي مؤسسة عسكرية‏، وترأس مؤسسة القذافي الخيرية للتنمية التي أنشئت عام 1998.

صيف عام 2000، شارك سيف الإسلام باسم مؤسسة القذافي الخيرية في التفاوض مع مجموعة أبي سياف الفلبينية التي كانت تحتجز رهائن ألمانيين، واستطاع تحريرهم مقابل مبلغ مالي يقدر بـ‏25‏ مليون دولار‏.‏
وساهم في تسوية "ملف لوكربي" الذي اتُّهمت فيه ليبيا بإسقاط طائرة "بان أميركان" المتجهة إلى نيويورك فوق بلدة لوكيربي الأسكتلندية يوم 21 ديسمبر/كانون الأول 1988، وهو ما أدى إلى قتل ركابها البالغ عددهم 259 شخصا، بالإضافة إلى 11 شخصا من سكان لوكربي. وبموجب هذه التسوية دفعت ليبيا مبلغ 2.7 مليار دولار للضحايا.
وكان له دور في حل ملف البرنامج النووي الليبي عام 2004، والذي كانت إزالته شرطا لفك الحصار عن ليبيا واستئناف علاقاتها مع الولايات المتحدة.
كما لعب سيف الإسلام دورا محوريا في تسوية ملف الممرضات البلغاريات اللواتي أفرج عنهن في يوليو/تموز 2007 بعدما أمضين هنّ والطبيب الفلسطيني المرافق لهنّ قرابة 8 سنوات في السجون الليبية، وذلك بعدما كان القضاء الليبي قد حكم على الجميع بالإعدام في مايو/أيار 2004، بعد أن أدانهم بنقل فيروس الإيدز إلى 438 طفلا في مستشفى بنغازي، توفي 56 منهم.
وبعد قيام ثورة 17 فبراير/شباط 2011، كان سيف الإسلام الشخصية الثانية في نظام القذافي، وتولى الدفاع عن والده عدة مرات على شاشات التلفزيون الليبي، منتقدا ومهددا الثوار الذين يصفهم بالعملاء والخونة.
وفي 27 يونيو/حزيران 2011، أصدرت المحكمة الجنائية الدولية مذكرات اعتقال بحق معمر القذافي ونجله سيف الاسلام ورئيس مخابراته عبد الله السنوسي، ليصبحوا مطلوبين للعدالة الدولية.

يوم 20 أكتوبر/تشرين الأول 2011، وفي مسقط رأسه مدينة سرت، قصف ثوار مدينة مصراتة موكب معمر القذافي، وألقوا القبض عليه قبل أن يلقى مصرعه على أيديهم عن عمر ناهز 69 سنة، ليضعوا بذلك نهاية لقصة جماهيرية القذافي.
وبعد مقتل والد بشهر واحد، أكد مسؤولون ليبيون في المجلس الوطني الانتقالي الليبي (الممثل للثائرين على نظام القذافي) اعتقال سيف الإسلام مع مرافقين اثنين له على الأقل في منطقة صحراوية قرب مدينة أوباري على بعد 200 كيلومتر عن مدينة سبها. وأودع في سجن بالزنتان.
سعت محكمة الجنايات الدولية لنقله من أجل محاكمته في مقرها بلاهاي علىارتكابه جرائم حرب وجرائم ضد الإنسانية خلال ثورة 17 فبراير، لكن السلطات الجديدة رفضت تسليمه، وعقدت محكمة ليبية عدة جلسات لمحاكمته بالفساد وجرائم الحرب ضد الثوار، وشملت المحاكمات مسؤولين كبارا في النظام السابق، وواجهوا اتهامات من بينها التحريض على إثارة الحرب الأهلية والإبادة الجماعية وإساءة استخدام السلطة وإصدارُ أوامر بقتل المتظاهرين والإضرار بالمال العام وجلب مرتزقة لقمع الثورة.
وفي 28 يوليو/تموز 2015، أصدرت محكمة استئناف في العاصمة الليبية طرابلس حكما بالإعدام رميا بالرصاص على تسعة من رموز نظام القذافي، من بينهم مدير المخابرات الليبية السابق عبد الله السنوسي، وآخر رئيس وزراء في عهد القذافي البغدادي المحمودي، ونجله سيف الإسلام الذي كان الحكم عليه غيابيا لتغيبه عن الجلسات لأسباب أمنية.

وفي السادس من يوليو/تموز 2016 حين كان الليبيون يحتفلون بعيد الفطر، فاجأ كريم خان محامي سيف الإسلام الجميع بتصريحه لقناة فرانس 24، ذكر فيه أن موكله سيف الإسلام قد خرج من السجن في 12 أبريل/نيسان 2016، بعد خمس سنوات قضاها وراء القضبان، مستفيدا من قانون العفو العام الذي "يطبق على كل الليبيين"، موضحا أن موكله "بخير وأمان وموجود داخل ليبيا".
لكن إدارة السجن الذي يعتقل فيه سيف الإسلام نفت ما يتداول بهذا الشأن وأكدت في بيان أن "سيف الإسلام القذافي لازال يقبع في سجنه ولم يتم الإفراج عنه حتى اللحظة"، كما نفت وزارة العدل الليبية الخبر، وذكرت أن "المتهم سيف الإسلام القذافي موقوف على ذمة قضايا عديدة، وما زال رهن التحقيق في بعضها والبعض الآخر منظور أمام القضاء".
لكن في يونيو/حزيران 2017، أفرجت كتيبة أبو بكر الصديق -الموالية لعملية الكرامة في الزنتان وهي التي كانت تحتجزه- عن سيف الإسلام، بعد اعتقاله لديها لأكثر من خمس سنوات، وبرر آمر الكتيبة العجمي العتيري قرار الإفراج بأنه جاء تنفيذا لمراسلات وزير العدل بالحكومة الموقتة، ومطالبة وكيل الوزارة في مؤتمر صحفي بضرورة الإفراج عن نجل القذافي وإخلاء سبيله طبقًا لقانون العفو العام الصادر من مجلس النواب الذي أقره في 28 يوليو/ تموز 2015.

اختفى أثر سيف الإسلام بعد الإعلان عن الإفراج عنه، لكن المحكمة الجنائية الدولية قالت إنها حددت مكانه في مدينة الزنتان جنوب غربي العاصمة طرابلس نهاية 2019، قبل أن يظهر عام 2021 في مقابلة مع صحيفة نيويورك تايمز التي نشرت له صورة يرتدي فيها عباءة سوداء مذهبة، وعلى رأسه عمامة سوداء وقد أطلق لحيته التي خالطها الشيب، وذكرت أنه في الزنتان، وأنه يلمح إلى احتمال ترشحه للانتخابات الرئاسية المقبلة.
وبالفعل، أكدت المفوضية العليا للانتخابات في 2021 أنه تقدّم بأوراق ترشحه للانتخابات الرئاسية المقررة قبل نهاية العام في مكتب المفوضية بمدينة سبها، وأنه استكمل جميع المسوغات القانونية بحسب قانون الانتخابات الرئاسية.
لكن مفوضية الانتخابات نفسها عادت لتستبعده من الترشح، وذلك لأن إحدى مواد قانون الانتخاب لا تنطبق عليه، وهي شرط: ألا يكون محكوماً عليه نهائيا في جناية أو جريمة مخلّة بالشرف أو الأمانة.

مساء الثلاثاء 23 فبراير/شباط 2026، أكدت مصادر ليبية رسمية وأخرى مقربة من سيف الإسلام القذافي مقتله في ظروف غامضة، ونعاه رسميا ممثله في الحوار السياسي الليبي عبد الله عثمان.
وذكرت وسائل إعلام ليبية أن سيف الإسلام قتل في مقر إقامته بمدينة الزنتان التي يقيم فيها منذ نحو 10 سنوات، وذلك بعد تعطيل كاميرات المراقبة، ومهاجمته من قبل 4 أشخاص مجهولين.
وبالرغم من تأكيد عدة مصادر مقتل سيف الإسلام في إطلاق نار، فإن الجهة التي أطلقت النار عليه والسياق الذي قُتل فيه لم يتضحا.